1、将印迹膜置于封闭液中，室温轻轻震荡20-60min，以封闭掉非特异性位点。
2、弃去封闭液，加入适量的一抗溶液，于摇床上轻轻震荡1h。（也可将印迹膜与一抗在2-8°C条件下孵育过夜。）
3、将印迹膜于洗脱液中悬浮清洗5min以上，并更换洗脱液4-6次。
4、将印迹膜与适量的HRP-结合物置于摇床上轻轻震荡，室温孵育1h。
5、重复步骤3以去除未结合的HRP-结合物
6、将A液和B液以1：1混合即得到超敏ECL化学发光工作液，推荐使用量为0.1mL/cm2。
7、将工作液与印迹膜于室温孵育5min。
8、将膜从工作液中取出，并用吸水纸吸去多余的液体，置于两层干净的保鲜膜之间，小心挤出印迹膜与保鲜膜之间的气泡。
9、将印迹膜置于暗盒中，蛋白面朝上，于暗室中进行X-光胶片曝光。
10、建议首次曝光时间为60s，进而通过调整曝光时间获得较好的实验结果。